В сравнение с контролната популация от мишки без мутаци, стимулираният от VEGF съдов ексудат е по-малък при мишките с недостатъчност на Ang-2. Подобни са отчетените резултати за цитокините хистамин и брадикинин. Резултатите показват, че Ang-2 има съществен принос за съдовите ексудати, индуцирани от тези цитокини.
Експериментални данни показват, че Ang-2 и VEGF заедно стимулират съдовата нестабилност, характеризираща се със съдови ексудати, възпаление и неоваскуларизация1-2
При патологични условия в ретината настъпва ангиогенен обрат и балансът се променя от антиангиогенни към проангиогенни фактори, включително положителна регулация на Ang-2 и VEGF.1
Стойности за Ang-2 в проби от човешко стъкловидно тяло
*p < 0,05; ****p < 0,0001.За да се покажат значимите разлики в контролните групи, беше използван непараметричен анализ на Kruskal-Wallis по метода на Дън за множествени сравнения. Адаптирано, източник: Regula JT, et al. EMBO Mol Med. 2016.;8(11):1265.–88.© 2019. F. Hoffmann – La Roche AG. Публикува се съгласно условията на лиценз CC BY 4.0. Статия със свободен достъп при условията на лиценз Creative Commons Attribution 4.0, съгласно които използването, разпространението и репродуцирането на всякакъв носител е разрешено, ако първоизточникът е цитиран точно.
Нивата на Ang-2 са повишени в стъкловидното тяло на пациенти със съдови заболявания на ретината или хориоидеята, включително AMD, DR и RVO, което потвърждава ролята на сигналния път Ang-2-Tie2 при тези патологични състояния.7-8
Изследванията показват, че Ang-2 засилва възпалението и съдовото протичане и улеснява действието на VEGF.2 4-7 Вижте доказателствата по-долу.
д.м.н. д-р Чарлс Уикоф Retina Consultants of Houston
ИЗПИТВАНЕ НА МОДЕЛИ НА КОЖА НА МИШКИ
Ang-2 може да увеличи съдовата пропускливост, провокирана от VEGF
Количествено определяне на съдов излив
**p < 0,01. Стълбчетата за статистическата грешка показват средната стойност ± стандартното отклонение. Адаптирано, източник: Benest AV, et al. PLoS One. 2013.;8:e70459.© 2013. Benest et al. Статия със свободен достъп при условията на лиценз Creative Commons Attribution, съгласно които използването, разпространението и репродуцирането на всякакъв носител е разрешено без ограничения, ако авторът и източникът са цитирани точно.
Индуцираният от VEGF съдов ексудат е по-малък при мишки с недостатъчност на Ang-2.
Установено е, че Ang-2 улеснява индуцираната от цитокини съдова нестабилност и сенсибилизира индуцираната от TNF ендотелна левкоцитна адхезия. На тази основа авторите Benest et al. правят хипотеза, че Ang-2 може също така да усилва действието на цитокините, допринасящи за съдова нестабилност, като VEGF, хистамин и брадикинин.5
Изследването с анализ на Майлс е извършено с мишки с недостатъчност на Ang-2 и стойностите са сравнени с тези при контролната популация от мишки без мутации. Анализът на Майлс показва способността на даден цитокин, инжектиран подкожно – например VEGF, – да стимулира съдов ексудат в сравнение с инжектирането на контролно вещество (физиологичен разтвор). Интравенозно се инжектира син пигмент на Еванс, който се свързва с албумините от васкулатурата. Изливът се наблюдава визуално като посиняване на кожата и се определя количествено с измерване на абсорбцията.
ИЗСЛЕДВАНЕ СЪС СПОНТАННА CNV ПРИ ОПИТНИ МИШКИ
1 седмица след последната доза антитела
5 седмици след последната доза антитела
**p < 0,01; ***p < 0,001. Стълбчетата за статистическата грешка показват средната стойност ± стандартното отклонение.†В експеримента са включени седемседмични мишки JR5558 (5-10 мишки на група). Графиките са адаптирани от постер на авторите Canonica J, et al. (№628), представен на виртуална среща на EURETINA през октомври 2020 г.
Намаляването на площта на протичане при CNV е по-продължително при инхибиране на Ang-2, отколкото при инхибиране на VEGF.
Хороидалната неоваскуларизация (CNV) прогресивно уврежда ретината. Както за VEGF, така и за Ang-2 е установено, че са фактори с определена роля в неоваскуларизацията, дисфункцията на ендотела и съдовите ексудати. Целта на това изследване е да се изясни ролята на VEGF и Ang-2 в патологичната неоваскуларизация и съдовите ексудати.
Експериментът е проведен върху миши модел на спонтанна CNV (JR5558), при който се развиват спонтанни пропускливи неоваскуларни лезии. Антителата за VEGF-A и Ang-2 са приложени чрез интраперитонеална инжекция, а флуоресцеиновата ангиография (ФА) е извършена в началото и в анализираните времеви точки (една седмица, три седмици и пет седмици след лечението [тук са показани седмици 1 и 5]). Взети са тъкани и размерът на CNV лезиите е определен въз основа на FA измервания на протичането от CNV, за да се определят незабавните и дългосрочните ефекти върху размера на лезиите, протичането и активността.
В сравнение с инхибирането на VEGF, инхибирането на Ang-2 води до по-продължителен ефект на намаляване на съдовото протичане от CNV лезиите. Ефектът от инхибирането на Ang-2 продължава поне пет седмици след лечението, докато инхибирането на VEGF престава да бъде ефективно след три седмици (данните не са показани тук). Тези резултати предполагат, че Ang-2 има по-съществен принос за продължителните съдови ексудати.
МОДЕЛ НА МИШКА С ДЕФИЦИТ НА PDGF-B†
Графично представяне/делеция на гена на Ang-2 в мишки с недостатъчност на PDGF-B
Графично представяне/IVT на антитела срещу Ang-2 в мишки с недостатъчност на PDGF-B
* p < 0,05 в сравнение с ретина без перицити. ** p < 0,01 в сравнение с контролната популация с Fc. Стълбчетата за статистическата грешка показват средната стойност ± стандартното отклонение.† Опитни мишки с изчерпани перицити в ретината с недостатъчност на PDGF-B в постнаталния период. Адаптирани графики, източник: Park DY, et al. Nat Commun. 2017.;16:15296.© 2017. Park et al. Статия със свободен достъп при условията на лиценз Creative Commons Attribution 4.0, съгласно които използването, разпространението и репродуцирането на всякакъв носител е разрешено без ограничения, ако авторът и източникът са цитирани точно.
Съдовите ексудати в ретината намаляват с изчерпване на перицитите след инхибиране на Ang-2.
Загубата на перицити или апоптозата е често срещана характеристика на DR, но участието на перицитните клетки в регулирането на BRB не е напълно ясно. Park et al. изследват ролята на тромбоцитния растежен фактор (PDGF)-B signalizirajući regrutaciju pericita, cjelovitost BRB-a i vaskularno propuštanje u žilama mrežnice te interakciju sa signalizacijskim putom Ang–Tie.7
Мишки с недостатъчност на PDGF-B или Ang-2/PDGF-B, специфичен за съдовите ендотелни клетки на ретината, са получени с рекомбиниране Cre-Lox. При мутацията се наблюдават различни фенотипове с характеристики, типични за DR, като нарушено покритие с перицити, нарушени съединения между клетките, хипоксия с повишени нива на VEGF-A и увеличено възпаление. Съдовите ексудати са анализирани с конюгиран с FITC декстран в P12 (лявата графика). Мишките без мутации, приели антитела срещу PDGF-B в P1, след това са инжектирани IVT с антитела срещу Ang-2 в P5 и съдовите изливи са анализирани в P8 (дясната графика).
Това проучване установява, че инхибирането на Ang-2 чрез генетична делеция или чрез блокиращи антитела намалява съдовата пропускливост в ретините с изчерпани перицити. Тези данни предполагат, че инхибирането на Ang-2 може да бъде от полза за подобряване на разрушаването на BRB и прогресията на DR, а следователно и за потенциалната патология на DME.
По време на възпаление цитокините, като TNF-α, стимулират експресията на адхезионни молекули върху повърхността на ендотелната клетка, като по този начин подпомагат свързването и адхезията на левкоцитите. Ang-2 действа като стимулатор на активирането и сенсибилизирането на съдовите ендотелни клетки към възпалителни цитокини чрез регулиране на прехода от левкоцитна адхезия към твърда адхезия и чрез улесняване на миграцията на левкоцитите през съдовия ендотел в тъкани като ретината.8-9
ИЗСЛЕДВАНЕ В ГРЪБНА КОЖНА ГЪНКА НА ОПИТНИ МИШКИ
Без мутации
С недостатъчност на Ang-2
Стълбчетата за статистическата грешка показват средната стойност ± стандартното отклонение.
Източник на графиките: Nature Medicine, 12(2), Fiedler U, et al., Angiopoetin-2 sensitizes endothelial cells to TNF-alpha and has a crucial role in the induction of inflammation, 235–9, авторско право (2006), с разрешение на Springer Nature Publishers.
При мишките с недостатъчност на Ang-2 липсва адхезия на левкоцити, което показва, че Ang-2 играе важна роля във възпалителния отговор.
По време на възпаление екзогенните стимули, като TNF-α, активират ендотелните клетки, като предизвикват експресия на адхезионни молекули, което води до адхезия на левкоцитите и последваща твърда адхезия, водеща до трансендотелна миграция на левкоцитите. Целта на това изследване е да се разбере ролята на Ang-2 в регулацията на тези възпалителни процеси.
В гръбната кожна гънка на контролни мишки от див тип и мишки с дефицит на Ang-2 е имплантирана титаниева рамка, която обгражда кожния бислой. Отстранява се един слой кожа, като се оставя слой, състоящ се от напречнонабраздена мускулатура, подкожна тъкан и епидермис, който се покрива със стъклено предметно стъкло, за да се даде възможност за микроскопско наблюдение на кръвоносните съдове.
На контролните мишки от див тип и на мишките с дефицит на Ang-2 интравенозно се инжектира флуоресцентно багрило, за да се визуализират левкоцитите във васкулатурата. Върху кожата е приложен TNF-α и същите съдове са наблюдавани след 10 минути, един час и два часа. Левкоцитите се считат за прилепнали, ако са останали неподвижни в продължение на поне 30 секунди. Подвижните левкоцити се отбелязват като процент на несвързаните клетки, наблюдавани за повече от 30 секунди.
След стимулация с TNF-α при мишки от див тип броят на подвижните левкоцити първоначално се увеличава, преди да се върне към изходното ниво, а броят на прилепналите левкоцити се увеличава с течение на времето. При Ang-2-дефицитни мишки след стимулация с TNF-α адхезията на левкоцитите се увеличава с течение на времето и се наблюдават по-малко адхезирани клетки в сравнение с мишките от див тип. Тези констатации предполагат роля на Ang-2 в контрола на прехода от адхезия към твърда адхезия на левкоцитите или на цялостната чувствителност на ендотелните клетки към възпалителни стимули (като TNF-α).
AMD: свързана с възрастта макулна дегенерация; Ang: ангиопоетин; BRB: кръвно-ретинна бариера; CNV: хороидална неоваскуларизация; DME: диабетен макулен оток; DR: диабетна ретинопатия; FA: флуоресцеинова ангиография; Fc: фрагментен кристализиращ регион; FFA: фундусова флуоресцеинова ангиография; FITC: флуоресцеин изотиоцианат; IVT: вътреочно; KOEC: инактивиран ген, специфичен за ендотелните клетки; nAMD: неоваскуларна свързана с възрастта макулна дегенерация; Px: ден x от постнаталния период; PDGF: получен от тромбоцити растежен фактор; PDR: пролиферативна диабетна ретинопатия; RVO: венозна оклузия на ретината; Tie: тирозин-протеин киназен рецептор; TNF-α: тумор некротизиращ фактор алфа; VEGF: съдов ендотелен растежен фактор; VEGFR: рецептор за съдов ендотелен растежен фактор.
Референции:
1. Saharinen P, et al. Nat Rev Drug Discov. 2017.;16:635.–61.
2. Joussen AM, et al. Eye. 2021.;35;1305.–16.
3. Regula JT, et al. EMBO Mol Med. 2019.;11:e10666
4. Regula JT, et al. EMBO Mol Med. 2016.;8(11):1265.–88.
5. Benest AV, et al. PLoS One. 2013.;8:e70459
6. Canonica J, et al. poster [br. 628] prezentiran na EURETINI u listopadu 2020., virtualni sastanak
7. Park DY, et al. Nat Commun. 2017.;16:15296
8. Augustin HG, et al. Nat Rev Mol Cell Biol. 2009.;10:165.–77.
9. Fiedler U, et al. Nat Med. 2006.;12:235.–9.
Вие сте медицински специалист?
Регистрирайте се и разберете повече за нашите продукти!
Вие сте медицински специалист?
Регистрирайте се и разберете повече за нашите продукти!
